|
::I nuovi marcatori tumorali: nuove problematiche::
 preleva PDF (preview)
Nelle ultime due decadi si è osservato un incremento esponenziale degli studi molecolari riguardanti i tumori, studi che hanno consentito una comprensione fine di diversi meccanismi coinvolti nella genesi e nella progressione dei vari tipi di neoplasia.
Ciò è stato reso possibile anche grazie a progressi considerevoli nelle tecniche di indagine del DNA, che hanno reso possibile l'analisi di una enorme quantità di dati in tempi brevissimi.
Ad esempio, la tecnologia del DNA-microarray consente di definire in modo quasi del tutto esaustivo le modificazioni cromosomiche che si sono verificate a livello somatico nel tessuto tumorale di un determinato soggetto; nel contempo, è possibile indagare simultaneamente la presenza di decine o centinaia di mutazioni puntiformi nei geni putativi coinvolti nella genesi e progressione tumorale finora noti. Insieme, queste due informazioni sono sostanzialmente in grado di fornirci una mappatura pressoché completa delle modificazioni genetiche che caratterizzano il tessuto tumorale di un individuo.
DNA-microarray. Si tratta di una tecnologia innovativa sviluppata negli anni '90, che ha consentito una vera e propria “svolta” nello studio del DNA e dell'RNA. La tecnica si basa sostanzialmente nel creare su una piccola superficie solida una collezione ordinata di sonde di DNA a sequenza nota; il supporto (microarray) sarà quindi una mappa ordinata di sequenze. Su ogni microarray vengono posizionate migliaia di sonde: è chiaro quindi che la loro produzione richiede apparecchiature robotiche molto sofisticate. Con i microarray è possibile individuare la presenza di un determinato RNA (e quindi l'attivazione di un determinato gene all'interno dell'intero genoma), la presenza di una mutazione o studiare il profilo di espressione genica, individuando cioè tutti i trascritti attivi in una sola volta. Lo studio degli RNA prevede innanzitutto la loro estrazione dalla cellula e successivamente la loro conversione in cDNA utilizzando la trascrittasi inversa; durante il processo di conversione i cDNA creati vengono marcati con una sonda fluorescente. A questo punto è possibile far avvenire la reazione di ibridazione tra questi cDNA e le sonde poste sul microarray; in caso di effettiva ibridazione sarà sufficiente rilevare il segnale fluorescente ed associarlo alla relativa posizione sul microarray per conoscere se una data sequenza era presente o meno nella miscela degli RNA di partenza. L'insieme di tutti i segnali di fluorescenza (migliaia), analizzati con appositi strumenti, fornisce il profilo completo di espressione genica di quella cellula o tessuto.
|
Queste nuove strategie di indagine molecolare del tessuto tumorale suggeriscono un cambiamento radicale nell’approccio alla diagnosi, prognosi e terapia del tumore, con un cambiamento da un presente in cui i marcatori tumorali sono caratterizzati dall'essere spesso organo-specifici e non tumore-specifici, avere bassa specificità, essere scarsamente prognostici, scarsamente predittivi e moderatamente farmacodinamici ad un futuro di marcatori altamente specifici, prognostici, predittivi e farmacodinamici.
Tale transizione pone in essere una nuova classe di problematiche, tutt'ora aperte; ne verranno qui citate tre; la progettazione di nuovi trials clinici, la non-invasività delle tecniche di prelievo dei materiali biologici e la distinzione delle alterazioni genetiche funzionali da quelle che rappresentano un “rumore di fondo” nel genotipo tumorale.
Nuovi trials clinici. Validare ed immettere nella routine clinica nuovi marcatori tumorali basati sulle alterazioni genetiche tumore-specifiche richiede la progettazione di nuovi trials clinici, con nuovi problemi di reclutamento e studio dei pazienti oncologici. Per quanto riguarda il reclutamento è necessario sottolineare che il profiling molecolare di un tumore può essere oggi talmente accurato da rendere virtualmente unico ogni carcinoma, impedendo così di individuare classi omogenee di soggetti nei quali avviare un trial clinico; in pratica, mancano conoscenze su come superare questo profiling spinto con biomarcatori tumorali che possano essere efficacemente utilizzati per selezionare gruppi di pazienti che possano beneficiare di una terapia piuttosto che di un'altra. Inoltre lo studio dei marcatori tumorali, necessita, per sua stessa natura, di informazioni dinamiche: è necessario quindi disporre di biopsie seriate dello stesso paziente effettuate in momenti diversi della storia clinica del suo tumore; ciò, naturalmente, è molto difficile da ottenere per i tumori solidi sia per la loro localizzazione che per l'impossibilità di programmare continue biopsie a fini di studio, molto più facile, invece, per quelli liquidi. Si ripropone in definitiva un motivo dominante in oncologia, quello delle maggiori informazioni disponibili per i tumori liquidi rispetto a quelli solidi. Un'alternativa alle biopsie seriate potrebbe essere quello di valutare farmaci sperimentali in pazienti che hanno già un intervento chirurgico programmato come parte integrante del loro trattamento; in questi casi è possibile somministrare il farmaco per un determinato periodo precedente all'intervento e quindi studiarne l'effetto confrontando il frammento bioptico ottenuto a fini diagnostici con quello prelevato in sede chirurgica, a trattamento quindi già avvenuto. Un esempio di questo approccio è il trattamento con ripamicina di pazienti con glioblastoma; la ripamicina (il cui nome commerciale è Sirolimus) è un inibitore di mTOR, il cui pathway aberrante nel tumore è sotto il controllo del gene oncosoppressore PTEN: i pazienti in cui manca PTEN (che inibisce la produzione di mTOR) sono sensibili al trattamento con la ripamicina; in questi pazienti il trattamento con ripamicina viene effettuato prima del secondo intervento chirurgico (comunemente pianificato dopo la resezione iniziale), l'assenza di PTEN sul frammento bioptico ottenuto durante il secondo intervento seleziona i pazienti nei quali continuare la ripamicina (in questo caso il PTEN viene utilizzato come marcatore predittivo) e la verifica dell'efficacia del trattamento avviene dosando S6 e Ki-67, due molecole che si trovano a valle del pathway di mTOR e che quindi vengono utilizzate in questo caso come marcatori farmacodinamici (la cui assenza indica praticamente l'efficacia del blocco funzionale esercitato dalla ripamicina su mTOR).
Non-invasività delle tecniche di prelievo. Una delle caratteristiche fondamentali di ogni marcatore tumorale è rappresentata dalla non-invasività del reperimento del materiale biologico da studiare. Ciò vale, naturalmente, anche per i marcatori basati sullo studio del DNA o dell'RNA; se anche si riuscisse a mettere a punto degli eccellenti marcatori molecolari dotati di elevate performances in termini di informatività, resterebbe il problema rappresentato dal fatto che per studiarli sarebbe necessario effettuare una biopsia. Un filone di ricerca che cerca di superare questo problema è finalizzato ad individuare nel circolo sanguigno del paziente cellule dei vari tumori solidi, o, in alternativa, molecole che marchino in modo accurato l'andamento del tumore; ad esempio, alcuni studi indicano che nel circolo di pazienti affetti da carcinoma della mammella è possibile rilevare la presenza di cellule tumorali e che già il loro numero sia un buon marcatore prognostico. Ancora meglio le cellule tumorali della prostata isolate nel torrente circolatorio mostrano, da prime indagini, lo stesso pool di alterazioni genetiche delle cellule del tumore che le ha originate (come ad esempio l'amplificazione del gene per il recettore degli androgeni); se questi studi verranno confermati queste cellule potrebbero essere utilizzate come “specchio” di quello che avviene nel tumore solido, marcandone quindi l'andamento anche in corso di terapia. Questi primi successi sono tuttavia frenati da alcune limitazioni ad oggi difficilmente superabili come ad esempio il fatto che le cellule circolanti si osservano solo nei pazienti con metastasi e, soprattutto, il loro numero sembra essere estremamente esiguo (circa 1 cellula per ml di sangue).
Riassumendo, mentre i marcatori prognostici possono essere studiati utilizzando il frammento biotpico ottenuto in fase di diagnosi vi sono oggi discrete difficoltà nello sviluppo di marcatori predittivi e farmacodinamici i quali per essere studiati necessitano di continue biopsie nello stesso paziente in corso di terapia, procedura impossibile se non in rari casi e per pazienti terminali (il cui studio introduce peraltro bias cioè una pregiudiziale dovuta appunto allo stadio della malattia). La messa a punto di marcatori predittivi e farmacodinamici sul modello animale con successivo trasferimento all'uomo non fornisce risultati incoraggianti. I risultati più incoraggianti si hanno proprio dallo studio delle cellule circolanti dei tumori solidi; ad esempio l'amplificazione del gene per la proteina target del trattamento sembra essere il linea generale un buon marcatore predittivo.
Alterazioni funzionali e “rumore di fondo”. La grande mole di conoscenze acquisite in ambito molecolare grazie anche alle moderne tecnologie legate all'uso dell'informatica in campo biomedico ha consentito di individuare centinaia di strutture molecolari caratteristiche del fenotipo tumorale; tuttavia molte delle alterazioni genetiche riscontrate nei tessuti tumorali sono solo un “rumore di fondo” della trasformazione maligna: in altri termini non è ancora del tutto chiaro quali siano, per ogni tipo di tumore, gli eventi effettivamente cruciali per lo sviluppo e per la progressione del tumore. Alcune strategie sono risultate utili per facilitare l'opera di discernimento tra alterazioni rilevanti e “rumore di fondo”:
| |
[-] Analisi integrate dei meccanismi molecolari di disregolazione genica. Quando l'analisi dei tessuti tumorali consente di stabilire che un dato gene può essere alterato attraverso diversi meccanismi in differenti punti della sua struttura ed in momenti diversi del ciclo biologico che porta dal gene alla proteina, ciò indica con ogni probabilità che si tratta di un gene rilevante per la tumorigenesi. Un caso che si può portare ad esempio è quello del gene CDKN2A che codifica per la proteina INK4A (si tratta di un gene oncosoppressore): i meccanismi di disattivazione sono diversi, dalla delezione della regione cromosomica 9p21 che ospita il gene (alterazioni cromosomiche) alla metilazione del promotore (mutazioni epigenetiche), fino alle mutazioni puntiformi. Se un elemento genetico è veramente importante per lo sviluppo del tumore, la pressione selettiva sul clone in trasformazione troverà il meccanismo per disregolare quel gene; osservare quindi una sua disregolazione attraverso meccanismi molecolari eterogenei consente di concludere ragionevolmente che quello è un elemento genetico importante e non un semplice “rumore di fondo”.
[-] Analisi comparativa interspecie. Allo stesso modo se un gene risulta coinvolto nella tumorigenesi in specie differenti è ragionevole pensare che possa essere un elemento importante.
[-] Analisi di linee cellulari. Pur con tutte le cautele dovute al fatto che è ormai noto che linee cellulari provenienti da tumori umani sono solo dei modelli sperimentali per studi che poi necessitano di ampie conferme nel modello animale, tali modelli in vitro sono risultati finora comunque quasi invariabilmente veritieri quando si tratta di validare la funzione di un elemento genetico di interesse (ad esempio il test di interferenza con RNA in linee cellulari non fallisce nel confermare l'utilità o meno di una alterazione genetica per la progressione neoplastica).
|
La strada per necessaria per colmare questo gap appare oggi in salita, ma un'attenta analisi dei successi fin qui resi possibili offre spunti di riflessione sul come sia possibile individuare le alterazioni genetiche causative e distinguerle da quelle che sono rumore di fondo, in modo da utilizzare le relative molecole come antigeni per la marcatura biologica del tumore a fini diagnostici, prognostici e terapeutici. Ecco qui elencati alcuni casi di successo.
| |
[-] Traslocazioni cromosomiche: il caso della Leucemia Mieloide Cronica. Una delle prime aberrazioni genomiche associate ai tumori fu scoperta nel 1960 da Peter Nowell e David Hungerford; la traslocazione tra i cromosomi 9 e 22 determina la formazione di un prodotto di fusione dei geni BCR e ABL. Il gene chimerico che si forma a seguito di tale traslocazione cromosomica codifica per una tirosin-chinasi disregolata che conferisce alla cellula portatrice un vantaggio proliferativo. Questa alterazione cromosomica è ormai nota per essere causativa della LMC e di alcune forme di LLA. A circa 30 anni dalla scoperta del cromosoma Philadelphia è stata sviluppata una molecola in grado di bloccare la proteina ABL espressa sotto il promotore di BCR: si tratta dell'imatinib mesilato (Glivec). Il Glivec è oggi comunemente utilizzato nella pratica clinica per trattare i pazienti con LMC positivi per il cromosoma Philadelphia. Una quota di pazienti in trattamento con il Glivec acquisisce però una resistenza al farmaco, dovuta allo sviluppo di cloni recanti una mutazione puntiforme che annulla l'effetto inibitorio dell'imatitib mesilato; recentemente altre due molecole, il nilotinib ed il desatinib sono state approvate per la loro capacità di curare con successo i soggetti LMC Glivec-resistenti. Questo è un eccellente esempio di come la comprensione molecolare delle origini di un tumore, nella fattispecie dovuto ad un'alterazione cromosomica, abbia consentito di sviluppare dapprima un marcatore biologico (il cromosoma Philadelphia) e, successivamente, un agente terapeutico in grado di bloccare il tumore. L'approccio reiterativo consente oggi di trattare anche i soggetti che sviluppano resistenza al farmaco e tale successo è in parte dovuto al fatto che i tessuti tumorali dei soggetti affetti e trattati con Glivec sono stati correttamente raccolti in grandi banche biologiche di tessuti che hanno consentito uno studio a posteriori della biologia delle cellule dei soggetti sensibili e resistenti al Glivec.
[-] Amplificazione genica: il caso del carcinoma della mammella. L'oncogene ERBB2, come è noto, è amplificato in un terzo circa dei carcinomi mammari, conferendo loro un elevato grado di malignità; il prodotto genico di questo protooncogene è il bersaglio di un anticorpo monoclonale, il trastuzumab, che viene oggi usato con successo nella terapia dei tumori della mammella (selezionati appunto sulla base della presenza di amplificazione di ERBB2). Si tratta di un altro caso di successo in cui la comprensione molecolare di un meccanismo biologico ha consentito da un lato l'individuazione di un antigene da utilizzare come biomarcatore tumorale, dall'altro la messa a punto di un agente terapeutico efficace nella cura del tumore stesso.
[-] Mutazioni puntiformi: il caso di BRAF e EGFR. Il settore maggiormente indagato, quello della ricerca di mutazioni in geni responsabili del controllo della proliferazione cellulare, ha fornito le più importanti conoscenze sull'eziopatogenesi dei tumori, ma proprio per questo è il settore in cui si avverte maggiormente la distanza tra la mole di dati ottenuti nella ricerca e l'applicazione in ambito clinico. Tra i rari casi di successo è possibile citare i trials clinici che studiano gli inibitori di BRAF, la serin-treonin chinasi mutata con elevata frequenza (60%) nei melanomi, oltre che nei carcinomi colorettali (10%) ed in altri tipi di cancro. Il trattamento con gefitinib e erlotinib, due anticorpi monoclonali che inibiscono l'EGFR (epidermal growth factor receptor) è ormai routinario in pazienti con carcinoma del polmone di tipo NSCLS (non-small cell lung carcinoma) che presentano mutazioni nel relativo gene, mutazioni utilizzate quindi come marcatore tumorale. Anche in quest'ultimo caso il successo nella messa a punto della strategia terapeutica è stato possibile grazie agli studi sui tessuti conservati.
[-] I tumori ereditari: il caso di BRCA1 e BRCA2. Anche l'applicazione delle conoscenza acquisite nel campo della ricerca di geni che conferiscono la suscettibilità allo sviluppo di tumori su base ereditaria è piuttosto lenta ad entrare nella routine della clinica, sebbene in molti casi si conosca nel dettaglio la natura del gene alterato nella linea germinale, si conoscono gli hot-spot di mutazione e siano disponibili tutte le tecniche anche non invasive ed economiche per l'indagine molecolare. In questo caso i problemi sono sostanzialmente legati al fatto che le sindromi associate alle mutazioni germinali di geni per la suscettibilità allo sviluppo di tumori sono caratterizzate quasi sempre da penetranza incompleta ed espressività variabile ed è quindi spesso difficile stabilire un'esatta corrispondenza tra presenza di mutazione germinale, età di insorgenza e gravità della malattia; si aggiungono poi i noti problemi di natura bioetica che scaturiscono da un'indagine familiare per avere il quadro di quanto sia difficile mettere a punto metodiche standard con biomarcatori. Un caso di successo è quello dei geni BRCA1 e BRCA2, le cui mutazioni germinali sono associate all'insorgenza di tumori della mammella; screening per la ricerca di mutazioni in questi due geni vengono oggi realizzati in diversi paesi del mondo.
|
........................................................................................................................
per citare questa rassegna:
Buonsanti G. (2008) I biomarcatori tumorali, [http://www.biomedit.it/speciali/marcatoritumorali] |
